HRP標(biāo)記難，您選對(duì)試劑盒了嗎？

一、引言

為了在WB/IHC/IF等免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行特異性蛋白的檢測(cè)，需要在抗體或蛋白質(zhì)上偶聯(lián)上酶、熒光素、生物素、膠體金等追蹤物，并借助于熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測(cè)儀或電子顯微鏡等精密儀器對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，從而可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上進(jìn)行定性和定位研究，也可應(yīng)用于各種液相和固相免疫分析中。

免疫酶標(biāo)記技術(shù)是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)，酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性。酶標(biāo)記中，常用的就是辣根過(guò)氧化物酶（HRP），HRP能通過(guò)催化有過(guò)氧化氫參與的一系列氧化還原反應(yīng)并釋放信號(hào)，因此被廣泛應(yīng)用于免疫印跡(WB)，酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)，以及免疫組織化學(xué) (IHC) 等實(shí)驗(yàn)中。

辣根過(guò)氧化物酶HRP上的糖羥基可以被高碘酸鈉活化生成醛基，這些醛基能通過(guò)Schiff堿與蛋白中的氨基偶聯(lián)，緊接著還原Schiff堿形成穩(wěn)定的偶聯(lián)產(chǎn)物。雖然這種HRP標(biāo)記方法已經(jīng)被廣泛認(rèn)可和應(yīng)用，但是也存在一定的缺陷，標(biāo)記過(guò)程較為繁瑣和耗時(shí)，而且標(biāo)記后酶的活性容易丟失。洛陽(yáng)佰盛生物技術(shù)有限公司提供了一種簡(jiǎn)單快速的HRP標(biāo)記試劑盒。能夠解決現(xiàn)有標(biāo)記方法的這些缺陷。

圖1：HRP快速標(biāo)記試劑盒（洛陽(yáng)佰盛生物）

二、標(biāo)記原理與應(yīng)用

高碘酸鈉氧化法活化辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的糖基，經(jīng)過(guò)活化的HRP帶有醛基可以與待標(biāo)記物的游離氨基結(jié)合，發(fā)生希夫堿反應(yīng)（Schiff's base reaction）。本試劑盒適用于帶有游離氨基的物質(zhì)的標(biāo)記，比如：帶有游離氨基（伯胺）的抗體、蛋白或者小分子化合物。

試劑盒內(nèi)包括：預(yù)活化HRP、標(biāo)記啟動(dòng)液、反應(yīng)終止液干粉、標(biāo)記物保存液、備用透析袋(MD6，截留量12KD）。

三、產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

（1）活性強(qiáng)：可以標(biāo)記100μg的抗體或蛋白。

（2）標(biāo)記效果好，標(biāo)記率高，標(biāo)記后酶與抗體（蛋白）的活性均無(wú)重大損失。

（3）穩(wěn)定性高：HRP以凍干粉狀態(tài)-20℃能保存數(shù)年，但在溶液中很不穩(wěn)定且易失活（7天不失活），洛陽(yáng)佰盛生物制備的試劑盒采用特有穩(wěn)定技術(shù)，預(yù)活化的HRP在液體環(huán)境中4℃條件下可以保證1年內(nèi)開啟有效?？朔?/span>HRP在液體中的不穩(wěn)定性。

（4）操作過(guò)程快捷、簡(jiǎn)單，活化后的HRP保存在液體中，吸取方便，無(wú)須柱純化步驟。

（5）利用率高：與凍干形式的活化HRP相比，能夠穩(wěn)定保存在液體中的活化HRP減少了復(fù)溶過(guò)程及復(fù)溶后用不完廢棄造成的浪費(fèi)，可以用多少吸取多少，幾乎不會(huì)產(chǎn)生損耗。

四、標(biāo)記操作步驟

 （1）首先去除待標(biāo)記抗體或蛋白中的疊氮鈉、以及含有氨基的緩沖成分物質(zhì)，比如甘氨酸、Tris 等，還有EDTA等物質(zhì)，可采用透析和超濾的辦法置換緩沖液，以去除干擾物質(zhì)達(dá)到好的標(biāo)記效果！透析或超濾緩沖液可選0.01M CB，PH:9.6緩沖液(0.01M CB，PH:9.6緩沖液配制：取NaHCO3，0.67g和Na2CO3，0.21g加水到1L溶解完全即可，不用調(diào)節(jié)PH），若實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有碳酸鹽試劑再采用0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可）透析或超濾置換緩沖液，然后調(diào)整抗體或蛋白的濃度到2mg/mL。如果抗體和蛋白不含上述這些干擾物質(zhì)可以直接用上述PBS或CB緩沖液調(diào)整濃度到2mg/mL備用。

（2）從4℃取出HRP標(biāo)記試劑盒，使各組分充分混勻。

（3）取500μL抗體或蛋白（約1mg），加入50μL預(yù)活化HRP(1mg)液體中，用移液槍反復(fù)吹打幾次混勻，混勻后加入HRP標(biāo)記啟動(dòng)液99μL（加入啟動(dòng)液量依據(jù)：

每10μL蛋白和HRP混合液加1.8μL啟動(dòng)液）繼續(xù)混勻數(shù)次，避免產(chǎn)生氣泡。然后避光30℃～37℃溫箱偶聯(lián)反應(yīng)2～3小時(shí)，若遇快要下班也可放4℃反應(yīng)24小時(shí)左右（此法效果一樣或者更好不必?fù)?dān)心）。

（4）偶聯(lián)結(jié)束將反應(yīng)終止液粉管中加入1mL去離子水混勻，取50μL加入3所述反應(yīng)液中（加入終止液量依據(jù)：每1mg HRP加入終止液50μL），充分混勻，室溫放置1 小時(shí)或者4℃ 2小時(shí)。

（5）終止完成后，可直接加入等體積的標(biāo)記物保存液，充分混勻，置于-20℃保存。如果想更上長(zhǎng)期的保存建議先用0.067M PBS  PH:7.0（0.067M PBS， PH:7.0緩沖液配制：取NaH2PO4.2H2O，5.35g和Na2HPO4.12H2O， 11.7g以及NaCL，9g加水1L溶解完全，添加NaOH，0.35g再次混勻后即可，不用再調(diào)節(jié)PH）透析或超濾置換緩沖液后再加標(biāo)記物保存液。這樣可以保存3年左右甚至更長(zhǎng)。

圖2：標(biāo)記過(guò)程

五、標(biāo)記注意事項(xiàng)

（1）待標(biāo)記物緩沖液成分過(guò)于復(fù)雜以及含有氨基小分子和NAN3的初始緩沖液必須透析或超濾置換掉，請(qǐng)采用0.01M PBS（PH:7.0～7.4均可）或0.01M CB，PH:9.6緩沖液均可。

（2）如果待標(biāo)記物不是抗體是其它蛋白，那么請(qǐng)根據(jù)分子量參考蛋白和酶用量：若分子量在40KD以上建議1mg蛋白使用1mg HRP；如果分子量在30KD左右，建議1mg蛋白使用1.3mg HRP；如果分子量在20KD左右，建議1mg蛋白使用2mg HRP；如果分子量在10KD左右，建議1mg蛋白使用4mg HRP；此時(shí)啟動(dòng)液和終止液請(qǐng)按步驟（3）和（4）描述標(biāo)準(zhǔn)適量加入；如果標(biāo)記量為小于1mg的抗體或蛋白（可以0.1mg），HRP和其它試劑加入量按比例折算即可。

（3）小分子藥物不建議直接標(biāo)記HRP，因?yàn)?/span>HRP的結(jié)構(gòu)不能結(jié)合足夠的藥物會(huì)造

成效價(jià)偏低，這種情況建議先偶聯(lián)BSA增加小分子偶聯(lián)量再進(jìn)行HRP標(biāo)記，這樣效果會(huì)非常好。

（4）如果待標(biāo)記物含有其它蛋白需要把無(wú)關(guān)蛋白同樣計(jì)算進(jìn)去，盡管如此也請(qǐng)您慎重選擇這樣的樣品進(jìn)行標(biāo)記。

（5）本試劑盒保存4℃可以保證1年內(nèi)開啟有效，活化HRP開啟后小心取用切勿污染堿性物質(zhì)。

（6）終止液干粉一共5支，原則上每一支配好后僅限一次性使用，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)總量合理配制使用。

六、公司簡(jiǎn)介

洛陽(yáng)佰盛生物技術(shù)有限公司位于十三朝古都、牡丹花城、中國(guó)歷史文化名城洛陽(yáng)市。主要從事生物診斷技術(shù)與材料的研發(fā)、技術(shù)服務(wù)與技術(shù)轉(zhuǎn)讓；相關(guān)技術(shù)與材料的應(yīng)用范圍涵蓋食品安全檢測(cè)、動(dòng)物疾病診斷、人類疾病診斷、抗體制備、細(xì)胞培養(yǎng)及生命科學(xué)儀器等。客戶主要包括大學(xué)(食品科學(xué)院系、生物技術(shù)院系、醫(yī)學(xué)院系)、科研機(jī)構(gòu)、食品安全診斷試劑公司、動(dòng)物疾病診斷試劑公司、人類疾病診斷試劑公司。做好基礎(chǔ)研發(fā)，助力祖國(guó)科研是我們的主要目標(biāo)。目前公司擁有或授權(quán)使用的商標(biāo)有BIOABLAB\ABLAB。產(chǎn)品訂購(gòu)電話：0379-60665856，18903798022。